مدیریت بيماري ویروسی
مديريت بيماري ويروسی نياز به تشخيص دقيق و سريع جنس، خانواده، نژاد (Strain) يا واريانت (Variant) بيمارگر دارد. فنون تشخيص و كنترل ويروس دربرگيرنده شاخص‌هايی چون دقت، سطح ردگيري، شناسايی همزمان چند آلودگی (Multiplexing)، تعيين كميت (Quantification) و قابليت طراحی (Designability) می‌باشد.كنترل بيماري‌هاي ويروسی در دو محور اصلی مصون سازي با استفاده از ارقام مقاوم و انجام اقدامات حفاظتی براي جلوگيري از انتشار ويروس خلاصه می‌شود.
اقدامات پيشگيرانه
اقدامات پيشگيرانه دربرگيرنده مجموعه‌اي از روش‌هاي بسيار متفاوت است. اين اقدامات عبارتند از:
1)وارد كردن تركيب‌هاي پيوندي كنترل ويروس درختان ميوه از خارج از كشور، قرنطينه دو ساله گياهان زير نظارت سازمان حفظ نباتات
2)خريد و وارد كردن هسته‌هاي اوليه عاري از ويروس كاشتارها و يا پايه‌هاي رويشی در شرايط درون شيشه با اخذ گواهی سلامت از كشور مبدا
3)وارد كردن پيوندک و قلمه ارقام با گواهی از كشور مبدا
4)صدور گواهی سلامت عاري از ويروس (Virus free) و كنترل ويروس (Virus tested) براي ارقام و پايه‌هاي رويشی در دست تکثير در نهالستان‌ها كه همگی براي جلوگيري از ورود و انتشار آلودگی در جغرافياي باغبانی كشور به‌شمار می‌روند. هرچند عمليات قرنطينه بر آن گروه از مواد گياهی كه به صورت رسمی به كشور وارد می‌شود توسط سازمان حفظ نباتات صورت می‌گيرد ولی هيچ گونه اقدامات پيشگيرانه‌اي در نهالستان‌ها، جابه‌جايی و توزيع نهال در سطح داخلی بين استان‌ها صورت نمی‌گيرد. شيوع غالب بيماري‌هاي ويروسی به دليل نبود باغ‌هاي مادري سالم دراغلب مناطق توليد نهال كشور می‌باشد.
شکل1- هرس جوان‌سازی درخت سیب
سطوح ردگيري ویروس
شناسايی صحيح ويروس‌ها براي مديريت بيماري يک مرحله چالشی است. ردگيري و شناسايی ويروس‌ها بر اساس اختصاص يک ويروس در يک نمونه گياهی به گروهی از ويروس‌ها با ويژگی‌هاي مشترک می‌باشد. در بسياري از موارد به شناسايی گونه ويروس يا استفاده از فنون سرولوژيک بسنده می‌شود، ولی ردگيري می‌تواند واحدهاي طبقه‌بندي شده (Taxonomic) بالاتر تا تعيين جنس و خانواده و يا در اجزاي ريزتر در حد نژاد (Strain) نظير شناسايی واريانت‌ها، موتانت‌ها يا سرو تايپ‌ها (Serotypes) با مشخصات متمايز زيستی يا ملکولی از طريق به‌كارگيري مونوكلونال انتیبادي‌ها (Monoclonal antibodies) باشد. ظهور فناوري‌هاي توالی‌يابی با توان بالا (High-Throughput Sequencing) يک انقلاب در زمينه تشخيص ويروس‌هاي گياهی است. كشف ويروس جديد لوتئوويروس (luteovirus) در سيب از اين جمله است. از ديگر فناوري‌ها میتوان از نام برد (Nanopore sequencing ) و توالی‌يابی نانوحفره Molecule Real-Time (SMRT) ردگيري ويروس بايستی بر اساس روش‌هاي حساس و در طيف گسترده صورت گيرد، تا آنجا كه گفته می‌شود حذف مواد عاري از ويروسی كه مشکوک به آلودگی هستند به دليل ريسک انتشار مواد آلوده و گسترش بيماري ارجحيت دارد. بهره‌گيري از تجهيزات ردگيري در محل، به شدت در تصميم‌گيري سريع براي جلوگيري از واردات و صادرات ژرم پلاسم آلوده و شيوع بيماري كمک می‌كند. توالی‌يابی با ظرفيت بالا High-Throughput Sequencing (HTS)كه به عنوان توالی‌يابی نسل بعد شناخته می‌شود كه در كشف انواع آلودگی‌هاي ويروسی موجود در نمونه‌هاي بسياري از محصولات باغبانی كارآيی بسيار بالايی داشته است. در سطح جهانی، استقبال روزافزونی از اين ابزار در قرنطينه و نهالستان‌ها به چشم می‌خورد.
سالم‌سازي
در شرايطی كه هسته اوليه سالم ارقام و كاشتارهاي تجاري ارزشمند در دسترس نباشند توليد گياهان سالم با حذف ويروس‌هاي اصلی هر محصول براي عينيت بخشيدن و شکل‌گيري يک باغبانی پيش‌رو و اقتصادي ضرورت می‌يابد. سالم‌سازي با بهره‌گيري از فنون مختلف گرمادرمانی (Thermotherapy)، شيمی‌درمانی (Chemotherapy)، برق درمانی (Electrotherapy)، سرمادرمانی (Cryotherapy) و كشت بافت به تنهايی و يا در تلفيق با ديگر فنون انجام می‌گيرد. روش‌هاي مختلفی چون كشت رئوس مريستمی (Shoot tip culture)، گرما درمانی، شيمی درمانی و يا ريزپيوند (Shoot tip-grafting) به تنهايی و يا در تلفيق با يکديگر براي حذف آلودگی‌هاي ويروسی از درختان ميوه و پايه‌هاي رويشی كاربرد يافته است. تيمار گرمادرمانی در درجات دمايی مختلف، شيمی درمانی با استفاده از انتی ويروس ريباويرين (Ribavirin) به تنهايی و يا در تلفيق با ديگر تيمارها براي حذف سه ويروس Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), Apple stem grooving virus(ASGV), and Apple stem pitting virus ASPV از رقم سيب Xinhongjiangjun رايج در كشور چين به عنوان بزرگترين توليدكننده جهانی سيب اعمال شد. كارآيی حذف آلودگی‌ها با استفاده از دو جفت آغازگر براي هر ويروس توسط RT-PCR (reverse-transcription polymerase chain reaction) مشخص گرديد. استفاده از 15 و 25 ميکروگرم/ميلی‌ليتر ريباويرين علیرغم كند كردن رشد رويشی مواد گياهی، با حذف 74.4% تا 75% از آلودگی ويروسی زنده مانی تمام گياهان حفظ شد. ميانگين نرخ حذف ويروس در تيمار دمايی 34-36 درجه سانتی‌گراد به مدت 20 روز حداكثر به 45% رسيد. افزايش دما موجب افزايش معنی‌دار رشد و تکثير نمونه‌ها شد ولی در دماي 38 درجه سانتی‌گراد هيچ شاخه جانبی رشد نکرد. تلفيق تيمارهاي گرمادرمانی 36 درجه سانتی‌گراد با شيمی درمانی (μg/ml25) نرخ حذف ويروس ها تا 35، افزايش يافت. كارآيی حذف آلودگی ويروسی از جوانه‌هاي انتهايی و جانبی به ترتيب برابر 65.3% و 72.7% بود. نتايج اين بررسی نشان داد حذف ASPV آسان‌تر از حذف ACLSV و ASGV بود. كشت رئوس مريستمی نمونه‌هاي برگرفته از درختان سيب ارقام Danhong, Hongan, Saenara, Summerdream به مدت چهار هفته تحت گرمادرمانی در دماي 37 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. سپس با استفاده از آغازگرها اقدام به ردگيري چهار ويروس مهم سيب توسط RT-PCR گرديد. ميزان سالم سازي ارقام سيب به ترتيب برابر 28% ، 16% ، 12% و 12% بود. آنان نتيجه گرفتند گرمادرمانی روش مناسبی براي توليدگياهان سالم است. براي كاهش خسارات حاصل از انتشار وسيع Apple proliferation virus در نهالستان‌ها و باغ‌هاي مسن سيب روش‌هاي مبارزه متفاوتی به كار گرفته شده است. در اولين تيمار كنترل فيزيکی، قرار دادن نهال‌هاي آلوده سه ساله سيب به مدت دو روز در هواي گرم 38 درجه سانتی‌گراد اثر درمانی اساسی داشت، به حدي كه فعاليت حياتی ميکوپلاسما در محل پيوند نيز متوقف شد. اين تيمار در جوانه‌هاي نهال‌هاي پيوندي ناهنجاري هورمونی كمتري در مقايسه با شاهد (تيمارنشده) ايجاد نمود. دومين تيمار: روي قلمه‌هاي ارقام سيب در دماي 50 درجه سانتی‌گراد تا 55% موفقيت داشت و جوانه‌ها هيچ مشکلی نداشتند. سومين تيمار: غوطه‌ورسازي قلمه‌ها در آبگرم 50 درجه سانتی‌گراد براي دو ساعت بسيار خسارت بار بود. چهارمين تيمار: پرتودهی با اشعه ايکس و ماوراء بنفش اثرات در حد متوسط نشان داد. تيمارهاي شيمی‌درمانی مورد استفاده در اولين تيمار: موثرترين داروهاي شيميايی شناسايی شده با سميت كمتر به ترتيب نزولی عبارتند از:
1. Pyoctamin 10%
2. Chloramphenicol 10%
3. Tetracyclin وPenicillin با اثر درمانی 100% و میزان موفقیت موفقيت به ترتيب 55% ، 44% ،35% و 22% را داشتند. چهار دارو از نه داروي آزمايش شده بر درختان همان ارقام در مرحله باردهی طی دو سال، بر اساس متغيرهاي رقم وسيستميک بودن دارو، دامنه واكنش وسيعی در قابليت انتقال مشاهده شد. براي مثال در آخرين تيمار 1.1% Topsin M ، %0.076 Derosal ، 0.1% Benlate و در نهايت 0.2% Kasumin در 16 واريانت شدت بيماري كاهش نيافت بلکه موجب افزايش ميزان خسارت در گياه ميزبان گرديد.
احداث اولين باغ‌هاي كنترل ویروس سيب در كشور
در الگوي جديد واردات ژرم پلاسم، قبل از سفارش تركيب‌هاي پايه پيوندي درخواستی، تعداد نهال از هر تركيب پيوندي و مناطق مختلف آزمايشات سازگاري به صورت هدفمند مشخص شد. در يک پروژه ملی از 20 تركيب پايه پيوندي، همواره تركيب نهال شاهد پايه-رقم گلدن دليشز بر پايه بذري همسال انتخاب شد. پايه‌هاي رويشی جديد سالم كنترل ويروس براي همه مناطق اختصاص يافت. سال 1384، پس از دريافت نهال‌هاي تركيب‌هاي پيوندي كنترل ويروس يک ساله تامين شده در حد قابل قبول در چهار استان البرز، اصفهان، خراسان رضوي و آذربايجان غربی توزيع شد. در شرايطی كه تحقيقات و تاسيسات سالم‌سازي ابتدايی در كشور پا نگرفته بود، براي اولين بار دسترسی محدود به هسته‌هاي اوليه عاري از ويروس تركيب‌هاي پيوندي تجاري سيب ميسر شد. ويژگی‌هاي نهال با ذكر نام رقم-پايه رويشی و سطح سلامت گياهان از آلودگی‌هاي ويروسی توسط برچسب‌هاي آبی و سفيد رنگ الحاقی همراه با گواهی سلامت عاري از ويروس‌هاي مهم مورد نظر از سوي مؤسسه تحقيقات ميوه كاري رم ارائه شد. به اين ترتيب، همزمان 580 اصله از رقم پايه‌هاي رويشی (Cultivar rootstock) مالينگ و مالينگ مرتون عاري از ويروس MM106, M9، M26 ،MM111 با اهداف تحقيقات كاربردي پس از قرنطينه احداث كلکسيون پايه، تشکيل هسته‌هاي اوليه، باغ مادري پايه سالم با احداث خزانه تکثير عاري از ويروس بين چهار استان توزيع شد. زمستان 1384، چهار باغ تحقيقاتی عاري از ويروس در مناطق ايزوله استان‌هاي هدف احداث شد. تحقيقات سازگاري منطقه‌اي ارقام در قالب طرح ملی كليد خورد. صفات رويشی و نيز بررسی تجانس (Graft affinity) هر يک از ارقام بر پايه‌هاي كلونی انتخابی همراه با مقايسه با گياهان همسال آلوده (شاهد) انجام پذيرفت. در پايان ارقام فوجی كيکو، گالاشنيگا، ردچيف و جوناگلد معرفی شدند. متاسفانه آمار دقيقی درخصوص نهال‌هاي آلوده در كشور و شيوع آلودگی‌هاي ويروسی در دست نيست. به احتمال زياد يکی از دلايل عمده ميانگين عملکرد در واحد سطح پايين باغ‌هاي سيب كشور به دليل عدم سلامت نهال و نيز نبود علائم ويروسی بويژه در سنين جوانی نهال می‌باشد. طی دو دهه اخير تحقيقات وسيعی بر تاثير سلامت نهال بر كيفيت و كميت محصول و صفات رويشی درختان سيب صورت گرفته است كه در ذيل به آن اشاره خواهد شد.
ارزیابی عملکرد درختان كنترل ویروس و آلوده
و سلامت منطقه به علت عدم كاشت درخت‌هاي ميوه قبل از احداث سيب بود. نتايج بررسی‌هاي سه ساله در باغ آزمايشی كنترل ويروس ايستگاه مشکين آباد در مقايسه با درختان آلوده به ويروس باغ تحقيقاتی كمال‌شهر نشان داد درخت‌هاي آلوده توانايی تبديل گل به ميوه كمتري نسبت به درخت‌هاي سالم دارند. در مجموع، آلودگی‌هاي ويروسی باعث كاهش قدرت رشد، عملکرد و حتی زوال درخت‌هاي آلوده شدند. هرچند در تعداد زيادي از تلفيق‌هاي ويروس- ميزبان سرعت تنفس افزايش می‌يابد ولی بافت‌هاي ميزبان نکروزه نمی‌شوند. ممکن است اين وضعيت قبل از ظاهر شدن علائم ويروسی ايجاد شود و پس از توسعه بيماري ادامه يابد. سطح تنفس گياهان در آلودگی‌هاي مزمن اغلب كمتر از مقدار طبيعی است. در نتيجه درخت‌هاي آلوده توانايی كمتري در تشکيل ميوه نسبت به درخت‌هاي سالم دارند. نتيجه پژوهش‌هاي انجام شده در كرج، اروميه و سميرم نشان داد عامل‌هاي ويروسی بر ويژگی‌هاي وزن ميوه، تعداد عدسک، طول دم ميوه، طول ميوه، نسبت طول به قطر ميوه و نيز ويژگی عملکردي درصد ميوه‌بندي درخت‌هاي آلوده تاثير منفی داشت. هر گونه كاهش در سطح فتوسنتز به احتمال موجب بروز اختلال‌هاي متفاوت فيزيکی و شيميايی می‌گردد. بر اساس نتيجه‌هاي پژوهش‌هاي مختلف در سطح جهان، با افزايش سن درخت‌هاي آلوده و افزايش غلظت ويروس‌ها در اندام‌هاي رويشی، به ويژه در برگ‌ها به عنوان واحدهاي فتوسنتزي، كاهش كيفيت ميوه از ديدگاه ويژگی‌هاي ظاهري، شکل، اندازه، شدت رنگ رويی و ارزش غذايی نيز سرعت می‌يابد. به نظر می‌رسد افزايش سرعت زوال و كوتاهی عمر درخت‌ها به دليل كاهش سطح فتوسنتز با توجه به شکل تخريبی ويروس‌ها در انحراف توليد زيستی طبيعی آمينواسيدها و عدم تشکيل پروتئين‌هاي مورد نياز در گياه ميزبان باشد. پژوهش‌هاي مقايسه‌اي بين درختان سالم و آلوده در كرج نشان داد پس از ريزش‌هاي سه گانه درصد ميوه‌بندي و قدرت حفظ ميوه با افزايش تعداد ويروس‌هاي مهم كاهش يافت. با توجه به نتيجه‌هاي پژوهش‌هاي بومی در خصوص كاهش درصد ميوه‌بندي و عملکرد گياهان آلوده میتوان اذعان داشت علیرغم وجود ساعت‌هاي آفتابی زياد، سطح تشعشع بالا و رطوبت نسبی پايين شرايط اقليمی مطلوبی در مناطق عمده توليد سيب كشور، آلودگی‌هاي ويروسی يکی از عامل‌هاي مؤثر در پايين بودن سطح عملکرد در واحد سطح سيب بشمار می‌رود. بيمارگرهاي ويروسی به راحتی هم از طريق ابزارهاي باغبانی، پيوند و نيز توسط ناقل‌هايی چون قارچ‌ها، حشرات مکنده و يا نماتدها انتقال می‌يابند و درون گياه از سلول به سلول منتقل می‌شوند. رعايت استانداردهاي لازم در خصوص حفظ فاصله باغ‌هاي مادري سالم براي حفاظت از مواد گياهی عاري از ويروس ضرورت دارد.