تركيبات برگی سيب و جوانسازي
مطالعات انجام‌شده بر محتواي تركيبات فنولی برگ‌هاي سيب نشان داد بين كاشتارها اختلاف معنی‌دار وجود دارد. كاشتارآلدا Aldas ، داراي بيشترين ميزان تركيبات فنولی و فلاونوئيدها بود. فلوريدزين در دامنه 7.77 تا 13.36 ميلی‌گرم در ليتر به عنوان رايج‌ترين تركيب در برگ‌ها بود و ليگول Ligol با بيشترين ميزان از اين تركيب گزارش شد. بررسی درون شيشه‌اي عصاره‌هاي برگی كاشتارهاي سيب نشان دهنده وجود همبستگی مثبت بين فعاليت قوي انتی‌اكسيدانی با ميزان كل تركيبات فنولی و فلانوئيدي طی آزمونهاي مختلف بود. نتايج اين تحقيقات نشان می‌دهد همزمان با تحريک قدرت رويشی اندام هوايی، تمامی فرايندهاي سوخت و ساز سلولی و نيز بيوسنتز تركيبات انتی‌اكسيدانی افزايش می‌يابد. به دنبال افزايشی فعاليت انتی‌اكسيدانی تركيبات فنولی قدرت دفاعی گياه بهبود می‌يابد و در نتيجه آلودگی‌هاي قارچی دفع و يا كم می‌شوند. بر همين اساس، برخی محققين در آمريکاي لاتين با هدف مديريت تلفيقی و توليد محصول سالم به جاي كاربرد سموم اقدام به جوانسازي درختان رقم هلوي بومی كردند. تيمار جوانسازي موجب افزايش رشد شاخه‌ها، اندازه برگ، تراكم گلدهی، بهبود عملکرد و يکنواختی اندازه ميوه‌ها و از همه مهمتر موجب كنترل آفات و بيماري‌ها گرديد. نتايج اين بررسی سه‌ساله اثبات نمود تيمار جوانسازي به طور معنی‌داري موجب كاهش ابتلاي درختان به بيماريهاي قارچی مونيلياMonilia و كورينيوم Coryneum نسبت به شاهد گرديد. در آلمان تيپ‌هاي متفاوت آلو با ميوه‌هاي بسيار كوچک كشت و كار می‌شد و رقم Hauszwetsche رايج‌ترين آلو بود. طی يک دوره هفت ساله 1982-1976 ميلادي، يک به‌نژادگر به نام Hartman اقدام به ارزيابی و به‌گزينی 12 كلون برتر آلو از نظر صفات عملکرد، اندازه ميوه و قند بالا نمود. سال 1978 ارقام گزينش شده را تکثيركرد و آزمايشات سازگاري را در شش منطقه آغاز كرد. پس از پنج سال در سال 1983ميلادي اقدام به پيش‌گزينی Pre-selection ژنوتيپ‌هاي سازگار براي مناطق مختلف كرد. عملکرد در درخت كلون‌هاي برتر، بيرون از زيستگاه اصلی خود، معادل 50 كيلوگرم در درخت و با ميوه‌هايی با ميانگين وزن پايين 28 تا 23 گرم ثبت شد. هارتمن دليل عملکرد متفاوت و غيريکنواختی اندازه ميوه كلون‌ها همراه با توليد سيخک روي شاخه‌ها را به جوانسازي نسبت داد. در نهايت شش كلون آلو Etscheid , Chraderhof 100, Gunser, Wolff, Meschenmoser, hüfer معرفی شدند. وي بدون اشاره به آلودگی‌هاي ويروسی اذعان نمود پس از هرس جوانسازي قلمه‌هاي خشبی سالم براي تکثير انبوه بين باغداران توزيع شده است.
تركيبات فاز انتقالی به بلوغ و جوانسازي
ژنتيک گياه مهمترين عامل در تحول و انتقال بافت مريستمی از مرحله جوانی به مرحله بلوغ است. گذر به مرحله گلدهی از بخش بالايی تاج آغاز میشود و رفته رفته به پايين تاج گسترش می‌يابد. در عين حال اين فرآيند تحت تاثير عوامل محيطی و يا برخی تيمارها می‌تواند به يکباره كل تاج درخت را در برگيرد. هرس جوانسازي فرايندي در جهت عکس تغيير فاز دوره نونهالی به بلوغ است. اظهار داشت در پايان مرحله جوانی و انتقال به فاز بالغ، نهال بر مبناي الگوي ژنتيک موجود در مريستم‌هاي انتهايی محتواي متفاوت پروتئين‌ها در مركبات و نيز تركيبات پلی‌پپتيدي در كاشتار گيلاس استلا (Stella) ثبت شده است. برخی تركيبات پلی‌آمينی رديابی شده در برگ نهال‌هاي درختان ميوه طی فرآيند تغيير فاز دوره جوانی به بلوغ، در برگ درختان جوانسازي شده نيز شناسايی شده‌اند.
واكنش گياه به آلودگی ویروسی از طریق تغيير متابوليت‌ها و تركيبات درون سلولی
در ليتوانی، طی بررسی تركيبات شيميايی برگ درختان سيب در شرايط معمول رشد، توسط گازكروماتوگرافی و گازكروماتوگرافی-مس اسپکترومتري، 28 تركيب شامل انواع روغن فرار، چهار تركيب ترپنوئيدي و هيدروكربن‌هاي اليفاتيک ردگيري و شناسايی شد. واكنش آنزيم‌هاي انتی‌اكسيدانی بر اثر آلودگی ويروس لکه سبزرد سيب (ACLSV) عامل بيماري ويرولا (viruela)، بر رقم انديکاتور بسيار حساس'GF305' هلو به اين ويروس، قبل از انکوباسيون كوتاه مدت و پس از انکوباسيون بلند مدت با تيمار سرمايی مطالعه شد. انکوباسيون كوتاه مدتACLSV موجب تغييرات معنی‌دار فعاليت‌هاي اسکوربات پراكسيداز، پراكسيداز و كاتالاز گرديد. اعمال انکوباسيون بلندمدت هيچنوع علائم ظاهري روي برگ‌ها و خسارت به غشاهاي سلولی مزوفيل هلو از نوع پراكسايش ليپيدها توليد نشد، ولی علی‌رغم هرگونه واكنش ريخت‌شناسی بررسی‌ها نشان داد افزايش تركيبات آنزيمی و همچنين فعاليت‌هاي انتی‌اكسيدانی برگ‌ها در چرخه آنزيمی ascorbate glutathione– cycle با فعاليت‌هاي آنزيمی glutathione-S- transferaseو superoxide dismutase همبستگی داشت. سایر بيمارگرها نيز به صورت مشابه عمل می‌كنند. براي مثال بيمارگر پوسيدگی طوقه در بافتهاي گياهی ميزبان، تغييرات فيزيولوژيک ايجاد میكند. علاوه بر اين، تغييراتی نظير اختلال در سوخت و ساز اسيدهاي آمينه، افزايش محتواي كل قند، كاهش جزئی محتواي سلولز و سطح نيتروژن، پتاسيم و فسفركل گزارش شده است. سطح فتوسنتز و تبخير و تعرق گياهان آلوده به بيمارگرهاي ويروسی دچار ايستايی شد.
فرآیند فعاليت ویروس در ميزبان
بيمارگر ويروسی چرخه سوخت و ساز سلول ميزبان را به خدمت می‌گيرد و سنتز پروتيين در سطح ريبوزوم را از مسير مورد نياز و طبيعی گياه ميزبان خارج میكند به طوريكه گياه مجبور به سنتز پروتئينهاي ويروس میشود. بيماريهاي ويروسی در بسياري از موارد در گياهان علائم آشکار ايجاد نمی‌كنند بلکه به صورت پنهان توان توليدي درختان آلوده را كاهش می‌دهند و اثر منفی بر كيفيت و عملکرد محصول می‌گذارند. وقتی غلظت ويروس در درختان جوان و مسن در سطوح پايين باشد هرچند علائم مشهودي ايجاد نمی‌شود ولی افت عملکرد، كاهش اندازه ميوه، عدم رنگ گيري كامل، كاهش تراكم رنگ رويی از جمله نشانه‌هاي نامحسوس فعاليت وخسارات بار ويروس‌ها به‌شمار می‌روند. بيشترين ميزان غلظت ويروس mosaicvirus Apple در برگ‌هاي جوان نهال‌هاي آلوده به ويروس جوان چهار رقم سيب قبل از شروع گلدهی مشاهده شد. در اواخر فروردين ميانگين غلظت ويروس ApMV در برگ‌ها 1.9 برابر بيشتر از گلبرگ‌ها، 41 برابر بيشتر نسبت به جوانه‌هاي خواب و 81 برابر بيشتر از بافت زاينده بود. غلظت ويروس در نمونه‌هاي برگی جوان برداشت شده پس از فروردين ماه به مرور كاهش يافت به طوري كه در مرداد ميزان آلودگی به صفر رسيد. براي ردگيريASPV با استفاده از روش پيوند دوبله (method grafting Double) از رقم محک سيب227 Spy استفاده شد. ناسازگاري بين پايه پيوندک و علائم epinasty روي گياه محک ظاهر شد.
علائم اختصاصی بيماري ویروسی
بررسی‌هاي سالانه درختان طی ارزيابی خصوصيات رويشی ارقام سيب مستقر در كلکسيون علائم پس‌رفت رشدي، كاهش شادابی وسلامت اندام هوايی مشاهده شد. جداي از علائم مربوط به فقر عناصر معدنی مهم چون آهن، كلسيم، پتاسيم و روي مانند كم برگی، كاهش سبزينگی، زرد برگی، سوختگی حاشيه برگ‌ها علائمی چون ريزبرگی، رزت شدن سرشاخه‌ها، كتابی شدن وخميدگی سرشاخه‌هاي علفی ثبت گرديد. به دنبال شدت يافتن علائم درختان دچار زوال شدند به طوريكه اين درختان طی سال‌هاي بعد در مرحله‌هاي شروع گلدهی، تمام گل تا فندقه سبز خشک شدند. مجموع اين علائم نشان دهنده آلودگی‌هاي ويروسی در باغ ارقام تجاري كلکسيون كرج بودند كه قبل از شروع غربال مشخص نبود. اين مطالعات و بررسی‌هاي ملکولی منتج به ردگيري وتشخيص 26 درخت آلوده به دو ويروس و شش درخت آلوده به سه ويروس گرديد. درختان آسيب ديده به طور معمول پس از يک دوره سه تا پنج ساله از ظهور علائم مختلف دچار ضعف و زوال می‌شدند. بررسی‌ها نشان داد آلودگی‌هاي پنهان موجب افت شديد قدرت رشد، تغيير ساختار درخت، افت كيفيت ميوه مانند كاهش قند كل ميوه (Brix Grade)، بروز ناهنجاري‌هاي فيزيولوژيک و كاهش چشمگير عملکرد در درخت می‌گردند.
شکل1- هرس جوان‌سازی درخت سیب
مبارزه
كنترل بيماريهاي ويروسی به دليل پيچيدگی، قابليت انتقال ويروس و نيز تغييرپذيري ژنتيکی بالاي آن بسيار دشوار است. راه‌هاي مبارزه با آلودگی‌هاي ويروسی می‌تواند استفاده از ارقام مقاوم، پيشگيري از انتشار ويروس از طريق قرنطينه، حذف گياهان آلوده، كنترل ناقل‌هاي طبيعی، سالم سازي، صدور گواهی سلامت و ديگر روش‌ها باشد.
ایمن‌سازي گياه از طریق به‌نژادي
یکی از راهبردهاي كنترل آلودگی استفاده از ارقام مقاوم است. اين مقاومت می‌تواند از طريق مقاومت ژنتيکی ناشی ازبه‌نژادي، انتقال ژن و يا ديگر روش‌ها باشد. به‌نژادي براي ايجاد مقاومت به ويروس در گياهان همواره به عنوان موثرترين و ساده‌ترين راه براي جلوگيري از خسارت‌هاي حاصل از بيماريهاي ويروسی كاربرد دارد. سازوكارهاي مقاومت بسيار متفاوت و تحت اثرات متقابل مراحل چرخه ويروس و گياه ميزبان می‌باشد. مقاومت به آلودگی می‌تواند داراي تفاوت‌هايی از نظر اختصاصی بودن، پايداري و ماندگاري داشته باشد. به‌نژادي براي مقاومت به ويروس يک فرايند طولانی و پرهزينه است، بنابراين براي مقرون به صرفه بودن الزاما بايستی از حفاظت ماندگار برخوردار باشد. امکان‌پذير بودن پيش‌بينی ماندگاري مقاومت ژنتيک ميزبان به بيماري ويروسی بستگی به طبيعت مقاومت، تغييرات ژنتيک لازم براي يک ويروس براي غلبه به مقاومت ميزبان و تاثير اين تغييرات بر سازگاري ويروس دارد. تغييرات ژنتيک مورد نياز براي داخل كردن ژن‌هاي مقاومت از كاشتارهاي تجاري يا گونه‌هاي وحشی به ارقام حساس با استفاده از تلاقی‌هاي برگشتی رايج‌ترين روش ايمن سازي در برابر آلودگی‌هاي ويروسی است. ايمن سازي به دو شکل است.
1-مقاومت مستقيم از نوع واكنش فوق حساس است كه توسط پروتئينهاي مقاومت هدايت میشود. رمزگزاري شده با الل‌هاي غالب (alleles Dominant) به طور مشخص قادر به شناسايی يک توالی يا يک الگوي تطبيقی از ويروس ژن است (Avirulence determinant, Avr) كه القاكننده مرگ سلول آلوده است. در شرايط مرگ سلولی، امکان انتقال ويروس به سلول‌هاي مجاور از بين می‌رود و از ايجاد آلودگی سيستميک جلوگيري میشود. به اين ترتيب ژن‌هاي ويروس مهلک خاموش و غير فعال میشود (silencing Gene). تيم پژوهشگر چين و ژاپنی از توليد واكسن گياهی بر عليه يک ويروس Apple latent spherical virus (ALSV) ايزوله شده از درخت سيب در ژاپن خبر می‌دهند. سطح مقاومت يا تحمل ميزبان به آلودگی به احتمال با نبود آلودگی و فقدان علامت از طريق آناليز زنده‌مانی ميزبان قابل ارزيابی است.
2- مقاومت غيرفعال توسط الل‌هاي مغلوب مقاوم Resistance recessive alleles گياه ميزبان عليه ويروس مهاجم رمزگزاري می‌شوند. به‌نژادگران به طور معمول به دنبال مقاومت كامل در ژرم پلاسم و كاشتارهاي درختان ميوه هستند به طوريكه ويروس در آن‌ها آلودگی سيستميک ايجاد نکند. آزمون الايزا و هيبريداسيون ملکولی ابزار مناسبی براي تشخيص بررسی مقاومت تعداد زيادي از ژرمپلاسم و كاشتارهاي تجاري به صورت همزمان می‌باشد. در صورت امکان‌پذير نبودن ايجاد مقاومت كامل در عمليات به‌نژادي، می‌توان از مقاومت نسبی به معناي كاهش انباشتگی ويروس يا كاهش غلظت ويروس نيز بهره گرفت. در همين جهت تحمل نسبی به مفهوم كاهش خسارت ويروس بدون تاثير بر تکثير آن نيز می‌تواند راهکار مناسبی باشد. به هرشکل، به‌نژادي براي مقاومت به ويروس براي بسياري از گونه‌هاي گياهی و ويروسی به علت نادر بودن ژن‌هاي مقاوم در خويشاوندي‌هاي ژنتيک سازگار متناسب نيست. ژن‌هاي موتانت‌هاي مقاوم به ويروس می‌توانند در بسياري از اعمال مهم زيستی دخالت نمايند لذا احتمال واكنش‌هاي نامطلوب و غيرمنتظره در فرآيند رشد و فيزيولوژي گياه در اين موتانت‌ها دور از انتظار نيست. به همين دليل برخی محققين اظهار داشتند علی‌رغم گسترش فنون بيوشيمی گياهی و فناوري‌هاي ريزملکولی، برنامه‌هاي جهش‌زايی گياهان دچار وقفه شده‌اند. اكنون تلفيق تنوع با جمعيت‌هاي جهش يافته با استفاده از روش‌هاي بسيار جديد غربال، شناسايی صفاتی كه از طريق متدهاي غربال كلاسيک به‌نژادي امکان‌پذير نبود در سطح ملکولی ميسر شده است. به‌نژادگران اقليم گياهی علاقمند به تنوع ژنتيک ميزبان هستند ولی نبايستی از تنوع ژنتيک ويروس‌ها غفلت شود. شناسايی واريانت‌هاي ويروس با جهش‌هاي ناگهانی آن با استفاده از Multiplex real- timeq PCR به عنوان ابزار ارزشمندي براي شناسايی انتشار سه ويروس مهم سيب برشمرده شده است. يک روش ديگر مصون سازي حفاظت تقاطعی Cross protection ايجاد مقاومت عليه سويه‌هاي خشن و مهاجم ويروس از طريق واكسينه كردن گياهان با تلقيح سويه ضعيف شده همان ويروس است.